Descriere: 

Examenul citologic al aspiratului medular alaturi de biopsia medulara, reprezinta  investigatia esentiala in diagnosticul hematologic.Medulograma se realizeaza atunci cand datele clinice, hemoleucograma, examenul morfologic al frotiului sanguin sau alte teste de laborator sugereaza posibilitatea unei boli hematologice primare sau secundare iar analiza morfologica a maduvei poate sustine diagnosticul.

Examinarea microscopica se face initial la magnitudinea de  10x/20x  pentru :

-aprecierea calitatii frotiului (prezenta  grunjilor, calitatea coloratiei, prezenta de artefacte),

-evaluarea celularitatii (raportul cu celulele adipoase)

- prezenta megakariocitelor,  a celulelor mielomatoase, a mastocitelor

-prezenta osteoblastilor / osteoclastilor, a grupurilor de celule tumorale (clustere)

-prezenta celulelor Gaucher, Niemann-Pick, a histiocitelor cu incluzii “albastre ca marea”, a granuloamelor.

-se identifica zonele de strivire a grunjilor medulari (zonele “centrale”), zonele intermediare cu celularitate bogata, in care celulele medulare apar izolate sau grupate in insule de hematopoeza (pastrand  intr-o oarecare masura structura  arhitecturala din maduva) si zonele periferice, cu celule mai putine (prin dilutie). La cazurile pediatrice, maduva apare ca o dispersie uniforma de celule.

 Examinarea ulterioara a frotiului cu obiectivul de 100x cu imersie se face pe cca 300-500 celule integre, din zonele intermediare[1]

Examenul citologic al aspiratului medular include:

  • Evaluarea celularitatii: aprecierea volumul de celule medulare  comparat cu alte celule componente ale maduvei (ex celulele adipoase). Gold standard pentru evaluarea celularitatii este biopsia medulara. In aspiratul medular, celularitatea medulara este diluata de sangele periferic aspirat   in acelasi timp cu sucul medular  fiind  intotdeauna mai scazuta comparativ cu celularitatea indicata  de biopsie la acelasi pacient.
  • Raportul G/E: raportul intre celulele seriei mieloide (G) si eritroide (E); este calculat pentru a aprecia celularitatea relativa a celor doua linii celulare majore.Ca regula de baza, raportul normal este intre 2:1 si 4:1.Raport scazut G/E  poate insemna hipoplazia seriei granulocitare sau hiperplazia seriei eritrocitare.
  • Evaluarea seriilor hematopoetice  din punct de vedere morfologic si maturativ, in vederea raportarii semicantitative a rezultatului ;
  • Identificarea  de celule anormale (celule leucemice sau tumorale)
  • Evidentierea  macrofagelor anormale din cadrul lipidozelor: celula Gaucher, celula Niemann-Pick, histiocitelor cu incluzii “albastre ca marea”

Din aspiratul medular se pot realiza teste aditionale care impreuna cu examenul citologic cresc acuratetea  diagnosticului  hematologic[4]:

  • Imunofenotiparea
  • Analiza genetica a cromozomilor
  • Testul FISH (Fluorescence in – situ hybridization)
  • Alte teste genetice si de biologie moleculara (mutatia JAK2,BCR-ABL , etc)

Evaluarea seriilor hematopoetice  din punct de vedere morfologic si maturativ in vederea raportarii semicantitative este partea cea mai consistenta  a examenului morfologic :

 

Evaluarea eritropoezei (seria eritrocitara)

Precursorii eritrocitari sunt: proeritroblastul (pronormoblastul), eritroblastul (normoblastul) bazofil, eritroblastul (normoblastul) policromatofil si eritroblastul (normoblastul) oxifil.
Scaderea raportului  granulo-eritroblastic (G/E), care normal este 2/1 – 4/1,  se întalneste in hiperplazia eritroida (numar crescut de precursori eritroizi medulari) care insoteste diferite tipuri de anemii (anemie feripriva, anemie megaloblastica, anemie sideroblastica, talasemie). Raportul poate fi marcat scazut si chiar inversat in anemiile regenerative (posthemoragica / hemolitica). Cresterea raportului G/E indica fie hiperplazia seriei granulocitare, fie eritroblastopenie.
Predominanta formelor policromatofile (~50%) si oxifile (>30%) indica o maturatie normala a seriei rosii. Cresterea procentului de eritroblasti bazofili ( > 5-20%) indica deficit de hemoglobinizare (din anemia feripriva, anemiile megaloblastice severe).

  • Proeritroblastul este o celula rotunda , mare, masurand 15 - 20 µm diametru. Nucleul ocupa aproape toata celula.Cromatina este dispusa intr-un desen fin reticular dar este mai intens colorata decat cromatina mieloblastului. Nucleolii sunt prezenti dar greu observabili. Citoplasma este bazofila, mai intens decat citoplasma mieloblastului.
  • Eritroblastul bazofil este mai mic decat proeritroblastul, cu nucleu care ocupa mai putin citoplasma, desenul cromatinian incepe sa se organizeze in blocuri, citoplasma este albastru inchis.
  • Eritroblastul policromatofil este de talie mai mica decat precedentul, cu nucleu organizat in blocuri cromatiniene evidente iar citoplasma devine gri sau gri-roz datorita continutului de hemoglobina sintetizata.
  • Eritroblastul oxifil este putin mai mare decat eritrocitul matur. Nucleul este mic, picnotic. Citoplasma este rosiatica, exact ca la eritrocitul matur.
     

 

Evaluarea granulopoezei (seria mieloida sau granulocitara)

Precursorii granulocitari sunt :mieloblastul, promielocitul, mielocitul neutrofil / eozinofil / bazofil si metamielocitul, alaturi de formele mature nesegmentate si segmentate neutrofile /eozinofile / bazofile. Celulele mieloide constituie elementul predominant din maduva, celulele mature fiind cele mai numeroase.

  • Mieloblastul este o celula rotunda , mare (14 – 18 µm diametru); nucleul ocupa aproape toata celula. Cromatina nucleara este foarte fina, cu 2-5 nucleoli vizibili. Citoplasma este bazofila dar nu atat de intens ca la eritroblast. Nu exista granulatii intracitoplasmatice.
  • Promielocitele au talie mai mare decat mieloblastul. Desenul cromatinian este mai pronuntat decat la mieloblast iar nucleoli sunt inca prezenti. Citoplasma este bazofila, cu o zona clara (zona aparatului Golgi) si granulatii azurofile .
  • Mielocitele sunt ceva mai mici decat promielocite. Au nucleu rotund sau oval, situat excentric. Patternul cromatinian este mai grosier decat la promielocit dar nucleoli lipsesc (mielocitul este celula matura mitotica) [1] Granulatiile intracitoplasmatice pot si neutrofile (fine, de talie variabila, culoare lila), eozinofile (granule mari, rotunde, culoare oranj-rosu) si bazofile (mari, forme neregulate, albastru inchis)
  • Metamielocitele au aceeasi talie cu mielocitele , deosebirea consta in forma nucleului usor incurbat, cromatina mai condensata  si citoplasma mai putin bazofila.
  • Neutrofilele nesegmentate au nucleu  in potcoava, fara lobi, cu cromatina condensate si citoplasma galben-roz, cu granulatii abundente , fine .
  • Neutrofilele segmentate difera de nesegmentate prin nucleul lobulat, cromatina nucleara foarte condensata. Eozinofilul matur are 2 lobi, neutrofilul matur are 2-4 lobi iar bazofilul matur are lobii greu de distins datorita granulatiilor care ii acopera.

 

Evaluarea megakariopoezei (seria megakariocitara)

Precursorii megakariocitari sunt :megakarioblastul, promegakariocitul (10% – 15 % din numarul total), megakariocitul netrombocitogen (60-70%) si megakariocitele trombocitogene (10-20%). Megakariocitele sunt celule foarte mari (30-150 µm), poliploide (8N, 16N, 32N etc.). Promegakariocitele au citoplasma intens bazofila (numar crescut de ribozomi) iar nucleul este nelobulat, cu aspect tanar. Megakariocitele netrombocitogene au citoplasma rosu-rubiniu datorita granulatiilor, iar nucleul este neregulat, cu  numar variabil de lobi. Megakariocitele trombocitogene au citoplasma cu granulatii cvasigrupate in viitoarele trombocite, au trombocite adiacente la periferia lor, iar nucleul este mai mic si mai dens. Megakariocitele constituie tipul celular cel mai putin abundent din maduva, de obicei ~ 1/ 100 leucocite.

 

Alte elemente celulare normale intalnite in aspiratul medular:

Monocitele  sunt identice morfologic cu cele din sangele periferic.Promonocitele au cromatina mai delicate, nucleoli vizibili, si cateva granulatii in citoplasma bazofila.

Macrofagele (histiocitele) deriva din monocite dar sunt de talie mai mare 20 – 30 µm diametru. Nucleul este oval cu desen cromatinian delicat si cu unul – doi nucleoli mici. Citoplasma este bleu-gri sau incolora si contine frecvent celule fagocitate, detritus celular si vacuole.

Limfocitele sunt similar cu cele din periferie, variabile ca numar, depinzand de gradul de contaminare al materialului examinat cu sange periferic.

Plasmocitele au talie variabila , usual cu diametrul cuprins intre 12 - 16 µm,rotunde sau ovale, cu nucleu mic, rotund plasat excentric. Cromatina este condensata si dispusa in blocuri. Citoplasma este albastru-inchis cu o zona paranucleara clara, ca o aura .

Mastocitele sunt usor de recunoscut prin continutul de granule albastru inchis care ocupa toata citoplasma acoperind  nucleul. Atunci cand este vizibil, nucleul are o structura cromatiniana veziculara.

Osteoclastele si osteoblastii sunt elemente celulare care apar rarisim in aspiratul medular. Sunt mai frecvente la copii sau la persoane cu hiperparatiroidism sau anumite tumori (reactie osteoblastica).

Osteoclastele sunt celule mari, cu diametrul de peste 100 µm. Pot fi confundate cu megakariocitele dar sunt multinucleare , cu desen cromatinian fin si cu nucleoli vizibili.

Citoplasma variaza de la usor bazofil la intens acidofil datorita continutului de granule acidofile.

Osteoblastii sunt celule ovale, cu diametru de aprox 30 µm. Apar frecvent in grupuri. Nucleul este frecvent excentric, cu cromatina uniform distribuita si 1-3 nucleoli. Citoplasma este bleu-pal cu zona clara centrozomala distinct  separata de nucleu (diferit  fata de zona clara paranucleara a  plasmocitului).
 

Recomandari: 

Medulograma poate fi recomandata in :

  • Investigarea unei citopenii (leucopenia ,trombocitopenie, bicitopenie sau pancitopenie) pentru confirmarea / infirmarea unei leucemii, sindrom mielodisplazic, hipo / aplazie medulara, agranulocitoza
  • Anemia nonhemolitica, care nu a fost diagnosticata ca anemie feripriva , prin deficit de vit.B12 sau folat , ori talasemie, necesita examinarea celularitatii medulare
  • Identificarea, stadializarea si monitorizarea leucemiei acute
  • Diagnosticul si monitorizarea sindroamelor mielodisplazice
  • Diagnosticul tezaurismozelor: boala Gaucher, boala Niemann-Pick, sindromul histiocitelor “albastre ca marea”
  • Investigarea unei gammapatii monoclonale pentru diagnosticul de  mielom multiplu sau boala Waldenström.
  • Diagnosticul si stadiul unor boli maligne metastazate in maduva.
  • Evaluarea rezervelor de fier din maduva (hemosiderina)

 

In tabelul de mai jos se regasesc recomandarile specifice de examinare citologica a aspiratului medular si de examinare histologica a biopsiei medulare [3]

 

+      examinare obligatorie

(+)    examinare optionala

Ø      examinarea nu este indicata

 

Modificari in parametrii Hemoleucogramei  / Supozitii de diagnostic

Ex .citologic din aspirat medular

Ex histologic din biopsie medulara

Neutropenie izolata inexplicabila

+

(+)

Anemie  izolata inexplicabila

+

(+)

Trombocitopenie izolata inexplicabila

+

(+)

Punctie alba

 

+

Bi sau Pancitopenie inexplicabila

+

+

Sindrom mielodisplazic

+

+

Leucemie acuta

+

+

(punctie alba  sau pentru evaluarea seriilor hematopoetice restante, atunci cand in aspirat se remarca un grad avansat de infiltrare medulara cu celule neoplazice)

Leucemia limfatica cronica

Ø

Ø

Limfoame

+

+

Leucemia mieloida cronica

+

+ (daca gena de fuziune BCR-ABL sau cromozomul Philadelphia nu pot fi detectate in sangele periferic sau daca nu poate fi aspirat suficient material la punctie)

Policitemia vera

+

+

Mielofibroza idiopatica cronica

+

+

Trombocitemia esentiala

+

+

Mielomul multiplu

+

+

Metastaze medulare

(+)

+

Granulomatoza

Ø

+

Boala Hodkin

Ø

+

Osteoporoza, osteomalacia

Ø

+

Leishmanioza

+

Ø

 

Interpretare valori mici: 
  • nu este aplicabil (NA)
Interpretare valori mari: 
  • nu este aplicabil (NA)
Interferente analitice: 

Gradul de dilutie al aspiratului medular cu sange in timpul manevrei de aspirare este variabil si poate afecta interpretarea celularitatii[1]

Evaluarea celularitatii medulare depinde de tehnica de executie a frotiurilor, (de modul de strivire a grunjilor urmat de etalarea materialului obtinut)

Unele celule (fibroblastii, celulele tumorale) nu pot fi aspirate prin tehnica de punctie-aspiratie (situatia numita”punctie alba”) si se asociaza, de regula, cu o patologie semnificativa (doar in 7% din situatii  s-a evidentiat , prin biopsie, o celularitate medulara normala)[1]

Tehnica de colorare a frotiurilor poate predispune la erori de interpretare

  • celulele sunt colorate excesiv in albastru: timp prea lung de colorare, buffer prea alcalin (incorect preparat/vechi), frotiuri vechi/frotiuri prea groase. Coloratia poate fi imbunatatita prin spalarea rapida si intensa cu apa distilata
  •  aria dintre celule este colorata: spalare inadecvata a lamei, sange recoltat pe heparina/posibila paraproteinemie
  • coloratia apare prea roz/rosie: buffer prea acid, timp prea scurt de colorare/spalare excesiva a lamei

Tehnica de examinare depinde de gradul de pregatire si de experienta profesionala a examinatorului.

Variatii fiziologice: procentul de limfocite la copii este mai mare in maduva (e.g la 18 luni, limita de normalitate pentru limfocite este de 43,55 % +/- 8,56 )[1]; plasmocitele sunt rare la copii.

Multe medicamente determina cresterea numarului de eozinofile medulare.
O citologie medulara normala nu exclude posibilitatea unei boli localizate intr-o alta zona a maduvei.
 

Interval de referinta 

 

Valorile de referinta sunt orientative si difera  functie de varsta, sex si zona anatomica punctionata (stern, creasta iliaca)

Un exemplu de  valori de referinta se regaseste in tabelul de mai jos [1]:

(aspirat creasta iliaca, subiecti 21-56 ani)

 

Tip de celula

Valori  % Barbati

Valori % Femei

Mieloblast

0 - 3

0-3

Promielocit

3.2 - 12.4

3.2 - 12.4

Mielocit neutrofil

3.7 – 10

3.7 – 10

Mielocit eozinofil

0 – 2.8

0 – 2.8

Metamielocite si nesegmentate

2.3 – 5.9

2.3 – 5.9

Neutrofile segmentate

21.9 – 42.3

28.8 – 45.9

Eozinofile segmentate

0.3 – 4.2

0.3 – 4.2

Bazofile segmentate

0 – 0.4

0 – 0.4

Limfocite

6 - 20

6 - 20

Monocite

0 – 2.6

0 – 2.6

Plasmocite

0 – 1.2

0 – 1.2

Proeritroblasti

0 – 1.5

0 – 1.5

Eritroblasti bazofili

0 - 5

0 - 5

Eritroblasti policromatofili

5 - 34

5 - 34

Eritroblasti oxifili

0 - 8

0 - 8

Megakariocite

6 - 77

6 - 77

Macrofage

0 – 1.3

0 – 1.3

Raport G/E

1.1 – 4.1

1.6 – 5.2